Система CRISPR–Cas9: програмоване розпізнавання мішені ДНК та високоточне редагування генів

«Комплекс ендонуклеази Cas9 із гідовою РНК працює як молекулярний скальпель із GPS-навігацією: знайшовши тринуклеотидний мотив PAM (5′-NGG-3′), він звіряє 20 нуклеотидів мішені й виконує точний дволанцюговий розріз ДНК.»

10–11 клас · Генна інженерія: CRISPR–Cas9

Механізм явища

Система CRISPR–Cas9 походить із адаптивного антивірусного імунітету бактерій та архей і була перетворена Емманюель Шарпантьє та Дженніфер Даудною (Нобелівська премія 2020 р.) на універсальний інструмент програмованого редагування геному. Рибонуклеопротеїновий комплекс складається з білка-ендонуклеази Cas9 та єдиної гідової РНК (sgRNA), яка містить 20-нуклеотидний спейсер («адресу мішені»).

Рівняння і закони збереження

Пошук мішені в геномі завжди починається з розпізнавання білком Cas9 короткого тринуклеотидного мотиву **PAM (Protospacer Adjacent Motif, для *SpCas9* це послідовність 5'-NGG-3') на нецільовому ланцюзі ДНК. Лише за наявності PAM білок розплітає подвійну спіраль ДНК, дозволяючи sgRNA утворити гібридну R-петлю** з комплементарним цільовим ланцюгом.

Вимірювання і застосування

Коли всі 20 нуклеотидів (особливо «seed»-регіон біля PAM) збігаються без помилок, активуються два нуклеазні домени: HNH розрізає цільовий ланцюг, а RuvC, нецільовий ланцюг за 3 п.н. від PAM, утворюючи дволанцюговий розрив (DSB). Клітина відновлює розрив або шляхом NHEJ (швидке зшивання з мікроінсерціями/делеціями для нокауту гена), або шляхом HDR (високоточне вбудовування нової послідовності з донорної ДНК-матриці).

Теоретичне виведення та аналіз закону

Механізм дії системи CRISPR–Cas9 (Нобелівська премія 2020 р., Е. Шарпантьє та Дж. Даудна) відбувається у три етапи: 1) Сканування PAM: білок Cas9 ковзає вздовж геномної ДНК у пошуках короткого мотиву **PAM (Protospacer Adjacent Motif, для *SpCas9* це 5'-NGG-3'). Без PAM фермент не розплітає ДНК навіть за повної комплементарності РНК; 2) Утворення R-петлі: знайшовши PAM, Cas9 локально розплітає спіраль, і 20-нуклеотидний спейсер гідової sgRNA спарюється з цільовим ланцюгом ДНК за правилом Чаргаффа; 3) Дволанцюговий розріз (DSB) і репарація: домен HNH розрізає цільовий ланцюг, а домен RuvC, нецільовий ланцюг на відстані 3 п.н. від PAM. Далі клітина виправляє розрив або шляхом NHEJ (негомологічне з’єднання кінців для вимкнення гена, нокауту), або шляхом HDR** (гомологічно-спрямована репарація за донорною ДНК-матрицею для точної заміни мутації).

Методична вказівка до розрахунку

Білок Cas9 обов’язково розпізнає мотив PAM (5'-NGG-3') перед утворенням R-петлі sgRNA–ДНК, а за наявності донорної матриці клітина здійснює точну гомологічну репарацію (HDR).

Фізичні параметри установки та одиниці СІ

Кількість некомплементарних помилок між sgRNA та ДНК (0, ідеальний збіг 20/20): 0 … 6 помилок, типове значення 0 помилок
Наявність мотиву PAM 5′-NGG-3′ поруч із мішенню (1: є PAM, 0: мутація PAM): 0 … 1 PAM, типове значення 1 PAM
Доступність донорної ДНК-матриці для гомологічної репарації HDR: 0 … 100 %, типове значення 65 %
Концентрація рибонуклеопротеїнового комплексу Cas9–sgRNA: 10 … 100 нМ, типове значення 50 нМ

Приклад із життя

Комплекс CRISPR–Cas9 працює як текстовий редактор «Знайти і замінити» для живої клітини! Гідова РНК несе точну адресу з 20 літер, але перед тим як розкрити книгу ДНК, білок Cas9 перевіряє трилітерний «пароль доступу» PAM (5'-NGG-3'), після чого робить ювелірний розріз обох ниток ДНК.

PAM (5'-NGG-3') + 20 нт sgRNA ⇒ DSB (HNH + RuvC) xrightarrowHDR / NHEJ Редагований ген

Питання

Ендонуклеаза *SpCas9* несе всередині молекулу гідової РНК (sgRNA) довжиною 20 нуклеотидів, комплементарну до цільового гена. Яка обов’язкова коротка послідовність має стояти в ДНК безпосередньо поруч із мішенню, щоб білок Cas9 зміг розплести подвійну спіраль, і як клітина виправляє дволанцюговий розрив за наявності донорної матриці ДНК?

Ваша відповідь Option B

Формула

Баланс енергії E = 0.0 J

Імовірність цільового редагування гена P_cut (%)

0.0 J

Термодинамічна стабільність гібриду sgRNA–ДНК (×1.5 %)

0.0 J

Частка точного вбудовування донорної матриці HDR (%)

0.0 J

Рис. Б-17. 3D-структура комплексу CRISPR–Cas9 на геномній ДНК: білковий двочастковий каркас Cas9, жовтий PAM-мотив 5′-NGG-3′, гібридна R-петля «гідова sgRNA, цільовий ланцюг ДНК» та каталітичні центри розрізання HNH і RuvC.