§ Х-28 Ферментативний каталіз: рівняння Міхаеліса–Ментен та конкурентне інгібування (10–11 клас · Біохімія та ферменти)
Комплекс фермент–субстрат ES, модель «ключ–замок», Vₘax, K_M та конкурентне інгібування. «Фермент, це молекулярна рука, чия долоня (активний центр) ідеально пристосована, щоб обійняти перехідний стан субстрату», Лайнус Полінг.
Теоретичний конспект і фізико-хімічний механізм
Ферменти (ензими), це високоспецифічні білкові біокаталізатори, які прискорюють біохімічні реакції в клітині в 10⁶–10¹² разів завдяки комплементарному зв’язуванню молекули субстрату S в активному центрі ферменту E з утворенням проміжного фермент-субстратного комплексу [ES]: E + S undersetk₋₁oversetk₁⇄ ES oversetk_catlongrightarrow E + P.
Застосування методу квазістаціонарних концентрацій Бріггса–Голдейна (d[ES]/dt = 0) дає класичне рівняння Міхаеліса–Ментен: v = (Vₘax[S])/(K_M + [S]), де Vₘax = k_cat[E]₀, гранична швидкість при повному насиченні всіх активних центрів ферменту, а константа Міхаеліса K_M = (k₋₁ + k_cat)/(k₁) чисельно дорівнює концентрації субстрату, за якої v = (1)/(2)Vₘax (що менша K_M, то вища спорідненість ферменту до субстрату).
Конкурентний інгібітор I має просторову будову, подібну до субстрату, і оборотно конкурує з ним за активний центр (E + I ⇄ EI). Це збільшує уявну константу Міхаеліса в α = 1 + [I]/K_I разів (K_M^app = α K_M), але за великого надлишку субстрату ([S] ≫ K_M^app) субстрат витісняє інгібітор, тому максимальна швидкість Vₘax не змінюється.
Приклад із життя
Фермент, це майстер-ключник із замковою щілиною (активним центром), а субстрат, ключ. Коли ключів дуже багато, усі майстри зайняті роботою і швидкість досягає стелі Vₘax. А конкурентний інгібітор, це «фальшивий ключ», який тимчасово застрягає в замку й заважає справжнім ключам!
Контрольне запитання та розв’язання
Чому при дуже високих концентраціях субстрату ([S] ≫ K_M) швидкість ферментативної реакції перестає зростати й виходить на горизонтальне плато v₀ → Vₘax = k_cat[E]₀, і як на Vₘax та уявну константу K_M^еф впливає конкурентний інгібітор I?
- А: При [S] ≫ K_M усі активні центри молекул ферменту зайняті субстратом ([ES] ≈ [E]₀, нульовий порядок за S); конкурентний інгібітор збільшує уявну константу Міхаеліса K_M^еф = K_M(1 + [I]/Kᵢ), але не змінює максимальну швидкість Vₘax
- Б: Фермент повністю руйнується при додаванні субстрату, тому швидкість падає до нуля
- В: Конкурентний інгібітор зменшує K_M і збільшує Vₘax удвічі
Підказка: При насиченні активних центрів ([S] ≫ K_M) швидкість прямує до Vₘax = k_cat[E]₀, а конкурентний інгібітор збільшує K_M^app без зміни Vₘax.
Доведення: За моделлю Леонори Міхаеліс і Мод Ментен (1913) фермент E оборотно зв’язує субстрат S в активному центрі з утворенням комплексу ES: v₀ = (Vₘax[S])/(K_M + [S]), де константа Міхаеліса K_M = (k₋₁ + k_cat)/(k₁) чисельно дорівнює концентрації субстрату, при якій швидкість становить рівно половину максимальної (v₀ = 0.5 Vₘax). При малих [S] ≪ K_M реакція має перший порядок (v₀ ≈ (Vₘax)/(K_M)[S]), а при великих [S] ≫ K_M настає насичення всіх активних центрів (v₀ ≈ Vₘax, нульовий порядок). Конкурентний інгібітор I, структурно схожий на субстрат, конкурує за той самий активний центр (E + I ⇄ EI), підвищуючи K_M^еф = K_M(1 + [I]/Kᵢ), проте великий надлишок субстрату здатен повністю витіснити інгібітор і досягти тієї ж границі Vₘax.
Основні формули та параметри 3D-симуляції
v₀ = (k_cat[E]₀[S])/(K_M^еф + [S]), K_M^еф = K_M≤ft(1 + ([I])/(Kᵢ) ), θ_ES = (v₀)/(Vₘax)
- Концентрація субстрату в розчині [S]: 0.25 … 12 ммоль/л (стандарт: 4 ммоль/л)
- Константа Міхаеліса K_M (спорідненість центру: менша K_M = міцніше): 0.5 … 5 ммоль/л (стандарт: 1.5 ммоль/л)
- Каталітичне число обертів ферменту k_cat (Vₘax): 2 … 14 с⁻¹ (стандарт: 8 с⁻¹)
- Концентрація конкурентного інгібітора [I]: 0 … 6 ммоль/л (стандарт: 0 ммоль/л)