§ Б-04 Напівконсервативна реплікація ДНК: реплікативна вилка Мезельсона–Сталя (10–11 клас · Реплікація ДНК)
Геліказа, ДНК-полімераза III, синтез 5′→3′, ведучий ланцюг і фрагменти Оказакі відстаючого ланцюга. «Усі відомі ДНК-полімерази здатні приєднувати дезоксирибонуклеотиди виключно до вільного 3′-ОН кінця ростучого ланцюга (у напрямку 5′→3′), що зумовлює асиметрію ведучого та відстаючого ланцюгів.»
Теоретичний конспект і фізико-хімічний механізм
Напівконсервативний механізм реплікації ДНК, передбачений Дж. Вотсоном і Ф. Кріком та блискуче доведений у класичному досліді М. Мезельсона і Ф. Сталя (1958) з важким ізотопом азоту ¹⁵N, полягає в тому, що кожна дочірня подвійна спіраль ДНК містить один старий (материнський) і один заново синтезований полінуклеотидний ланцюг.
У реплікативній вилці фермент ДНК-геліказа за рахунок гідролізу АТФ розриває водневі зв’язки між комплементарними основами (A=T та G≡C), а топоізомераза (гіраза) знімає торсійне суперскручування попереду вилки. Головне біохімічне правило полягає в тому, що ДНК-полімераза III здатна приєднувати дезоксирибонуклеотидтрифосфати (dNTP) лише до вільної 3'-OH групи праймера, тобто синтез завжди йде строго у напрямку 5' → 3'.
Через антипаралельність материнських ланцюгів на матриці 3' → 5' новий ведучий ланцюг (leading strand) синтезується безперервно у бік руху вилки, тоді як на матриці 5' → 3' відстаючий ланцюг (lagging strand) синтезується переривчасто у протилежний бік короткими фрагментами Оказакі (починаючи з РНК-праймерів, які видаляє ДНК-полімераза І, а розриви зашиває ДНК-лігаза).
Приклад із життя
Уяви дорожню бригаду (ДНК-полімеразу), яка вміє класти асфальт лише вперед (у напрямку 5'→ 3'). На одній смузі (ведучий ланцюг) вона їде слідом за бульдозером-геліказою без зупинки. А на зустрічній смузі (відстаючий ланцюг) їй доводиться щоразу проїжджати вперед і класти короткі ділянки назад (фрагменти Оказакі), які потім зшиває лігаза!
Контрольне запитання та розв’язання
Два материнські ланцюги ДНК є антипаралельними (3'→ 5' та 5'→ 3'), а ДНК-полімераза синтезує новий ланцюг виключно у напрямку 5'→ 3'. Чому в реплікативній вилці один дочірній ланцюг (ведучий) синтезується безперервно, а другий (відстаючий), короткими фрагментами Оказакі, і яка частка гібридних молекул ¹⁵N/¹⁴N утвориться у досліді Мезельсона–Сталя після 2 поколінь реплікації у легкому середовищі ¹⁴N?
- А: Обидва ланцюги синтезуються безперервно, а після 2 поколінь усі 100% молекул ДНК залишаються важкими
- Б: Ведучий ланцюг росте у бік руху гелікази (5'→ 3'), відстаючий синтезується фрагментами Оказакі у протилежний бік із подальшим зшиванням ДНК-лігазою; після k=2 поколінь частка гібридних молекул становить 2/2² = 50%
- В: Відстаючий ланцюг синтезується у напрямку 3'→ 5' без участі праймази
- undefined: Після 2 поколінь реплікації зберігається лише 1 материнський ланцюг (25% гібридних молекул)
Підказка: Обидва дочірні ланцюги синтезуються в напрямку 5'→ 3' (ведучий безперервно, відстаючий фрагментами Оказакі), а після k=2 поколінь у досліді Мезельсона–Сталя частка гібридних молекул становить 2/2² = 50%.
Доведення: Оскільки ДНК-полімераза каталізує нуклеофільну атаку 3'-OH групи праймера на α-фосфат вхідного dNTP, ріст ланцюга можливий лише у напрямку 5'→ 3'. На матриці 3'→ 5' ведучий ланцюг рухається слідом за геліказою безперервно. На антипаралельній матриці 5'→ 3' полімераза змушена рухатися від вилки, синтезуючи короткі фрагменти Оказакі (від РНК-праймерів), які потім зшиває ДНК-лігаза. За напівконсервативним механізмом після k циклів подвоєння з однієї важкої молекули ¹⁵N/¹⁵N у середовищі ¹⁴N серед 2^k молекул завжди рівно 2 молекули є гібридними ¹⁵N/¹⁴N (при k=2 це 2/4 = 50%), а решта 2^k - 2, повністю легкими ¹⁴N/¹⁴N.
Основні формули та параметри 3D-симуляції
5' → 3' синтез, N_ДНК(k) = 2^k, f_¹⁵N/¹⁴N = (2)/(2^k)
- Швидкість розплітання гелікази та руху вилки v_гел: 0.4 … 2.5 ум.од. (стандарт: 1.2 ум.од.)
- Вміст пар G≡C у матричній ДНК (3 водневі зв’язки): 20 … 80 % (стандарт: 50 %)
- Довжина фрагментів Оказакі на відстаючому ланцюзі: 2 … 5 сегм. (стандарт: 3 сегм.)
- Покоління реплікації k у досліді Мезельсона–Сталя (¹⁵N → ¹⁴N): 1 … 4 покол. (стандарт: 2 покол.)